2.3.4 3种检测方法的不同一致性分析
对于24例慢性HBV感染患者血清样本，3种试剂C、商品D和E的化试HBV DNA定量结果的一致性分析见图4～6。试剂C与D检测结果的剂对检测结果差值平均值为0.28 log10 IU/mL,差值标准差为0.30 log10 IU/mL,95%一致性界限为0.28±1.96×0.30(-0.30,0.86),95.83%(23/24)的点在95%一致性界限以内，其一致性界限范围内试剂C和D测定值的临床最大差异为0.85 log10 IU/mL(图4)。试剂C与E检测结果的血清响差值平均值为0.80 log10 IU/mL,差值标准差为0.72 log10 IU/mL,95%一致性界限为0.80±1.96×0.72(-0.62,2.21),95.83%(23/24)的点在95%一致性界限以内，其一致性界限范围内试剂C和E测定值的样本最大差异为1.96 log10 IU/mL(图5)。试剂D与E检测结果的定量的影差值平均值为0.51 log10 IU/mL,差值标准差为0.64 log10 IU/mL,95%一致性界限为0.51±1.96×0.64(-0.74,1.77),91.67%(22/24)的点在95%一致性界限以内，其一致性界限范围内试剂D和E测定值的不同最大差异为1.25 log10 IU/mL(图6)。3种试剂检测24例临床血清样本的商品差值分布特点见表4。
2.3.5 19例超出定量线性范围的化试临床血清样本检测结果比较
对于检测结果低于至少一种试剂定量下限的11例样本(表5):2例样本，3种试剂均未检出；2例样本，剂对检测结果试剂C和D均检出，临床但均低于其定量线性下限，血清响而试剂E未检出；7例样本，样本试剂C和D的检测结果均在其定量线性范围内，经Wilcoxon符号秩和检验，试剂C与D的检测结果间差异无统计学意义(P=0.498),而试剂E有2例未检出，另外5例虽检出，但均低于其定量线性下限。对于检测结果高于至少一种试剂定量上限的8例样本(表5):1例样本，检测结果均高于3种试剂相应定量上限；1例样本，高于试剂C和D的线性上限，试剂E检测的结果为8.42 log10 IU/mL;2例样本，试剂C的检测结果高于其线性上限，试剂D的检测结果在其定量线性范围内，分别为7.38、7.91 log10 IU/mL,试剂E的检测结果在其定量线性范围内，分别为7.17、7.68 log10 IU/mL;4例样本，试剂C和D的检测结果均高于其线性上限，试剂E检测的结果分别为7.57、6.75、7.32、6.96 log10 IU/mL。
2.3.6试剂C和D检测临床血清样本的相关性分析
对于43例慢性HBV感染患者血清样本，其中有31例血清样本的检测结果均在试剂C和D的定量范围内，相关性分析发现相关系数r=0.966(P<0.001),回归方程Y=0.903X+0.036。将试剂C检测这31例血清样本所得的结果以2000 IU/mL为截断，分为两组：≥2000 IU/mL组有18个标本，试剂C与D检测结果的相关系数r=0.950(P<0.001),回归方程Y=0.986X-0.235;<2000 IU/mL组有13个标本，试剂C与D检测结果的相关系数r=0.710(P=0.007),回归方程Y=0.672X+0.757,提示低病毒血症时2种试剂的检测结果相关性较差。
3讨论
HBV DNA是乙型肝炎诊治中最重要的分子标志物，可用于确定治疗指征和监测治疗等，例如指南建议尽早识别病毒学突破、调整抗病毒治疗，而病毒学突破(viral breakthrough)是指患者血清HBV DNA水平与最低值相比上升超过1 log10 IU/mL(10倍)。慢性HBV感染者的精准管理高度依赖于HBV DNA的准确定量，而影响HBV DNA定量准确性的因素很多，包括核酸提取所用样本量、核酸提取方法、样品中酶抑制剂、荧光定量PCR仪、PCR反应体系中模板浓度、PCR引物和荧光探针等。HBV DNA在不同的实验室可能应用不同的试剂检测，试剂的差异可能改变病毒载量结果，导致HBV DNA定量结果偏高或偏低，特别是在医学决定水平，因而可能影响临床决策。另外实验室在更换检测试剂时，临床一致性是最重要的指标，通过它来判断结果的等效性。因此用于患者诊断或治疗管理的决策不仅基于患者的状态，而且可能还依赖于当时所使用的检测方法和试剂。
目前我国市面上有多种国家药品监督管理局(NMPA)批准的基于荧光定量PCR技术的HBV DNA定量检测商品化试剂盒。本研究选择了2种进口试剂和3种国产试剂(表1),2种进口试剂A和B是目前国际通用的HBV DNA定量试剂，但由于价格高昂、检测成本高而在我国应用有限，更多的实验室用的还是国产试剂。因此选择了3种国产试剂C、D和E,为目前国内市场占有率较高的3种试剂，均采用各自配套的半自动化磁珠式核酸提取仪进行核酸提取。由于不同型号的荧光定量PCR仪可能影响检测结果,将3种试剂均在COBAS®Z480全自动荧光定量PCR分析仪上进行扩增。
本研究主要探讨应用不同的试剂检测临床血清标本HBV DNA的结果一致性，以评价不同试剂的临床性能以及在日常临床实践中互换使用的可接受性。本研究分为两部分，第一部分探讨不同试剂的差异是否影响HBV DNA检测结果，首先应用小样本量的临床混合血清样本对此进行验证，发现两种进口试剂A和B的检测结果差异无统计学意义，而C、D和E 3种国产试剂仅有C与试剂A的检测结果间无统计学差异，试剂D、E的检测结果均显著低于试剂A(P<0.05),提示这3种国产试剂的检测性能可能与国际公认的进口试剂之间存在差异；进一步验证3种国产试剂的检测性能，发现2个水平国家标准物质的实际检测值与其靶值的差值均小于±0.4 log10 IU/mL,符合我国NCCL室间质量评价标准HBV DNA定量检测的可接受范围≤±0.4 log10 IU/ml;3种国产试剂C、D、E的CV均小于5%,符合国际上常用的可接受定量标准CV≤5%,因此3种试剂的检测性能(正确度和精密度)均满足临床应用要求。
本研究第二部分扩大样本量探讨3种国产试剂在检测临床血清样本的定量结果一致性以及临床性能是否存在差异，发现试剂E的检出率略低于试剂C和D,可能存在漏检；3种国产试剂检测24例临床血清样本(3种试剂的检测结果均在其定量范围内)的结果在统计学上差异有统计学意义，并且分析发现：试剂C与D的相关性和一致性较好、D与E次之、C与E最差；进一步分析试剂C和D检测31例临床血清样本(2种试剂的检测结果均在其定量范围内)的结果发现，2种试剂检测低病毒载量的相关性与高病毒载量时相比差。这些均提示3种HBV DNA定量试剂的临床性能差异有统计学意义。
本研究中3种国产试剂的正确度和精密度均符合国家要求，但对临床血清样本的结果却存在显著差异，其原因可能包括：①核酸提取效率可能存在差异：虽然3种国产试剂都是采用敏感的磁珠法提取核酸，但血清上样量不同，例如试剂E的血清上样体积是C的3倍而洗脱体积、加入PCR体系的模板体积均相同(表1),理论上E的PCR反应体系中DNA浓度应高于C,但E的检出率却低于C,提示核酸提取效率可能存在差异；②PCR扩增效率可能存在差异：由于临床血清样本中存在PCR抑制剂如血红蛋白、肝素等，3种试剂的抗干扰能力可能不一致，从而导致其扩增效率可能存在差异；③检测不同基因型和突变病毒株的能力可能存在差异：3种试剂声称的检测亚型稍有差异，但究其各自能力如何未验证；3种试剂的引物和探针序列可能并不相同，HBV是一种高度变异的DNA病毒，抗病毒治疗中HBV DNA序列可能发生耐药性突变，若突变位于引物或探针结合区域，则可导致样本的病毒载量被低估；Liu等建议准确定量HBV DNA可能需要两个靶标，例如基于S和C区域的双重实时PCR检测。
总之，本研究发现3种常用国产试剂定量检测临床血清样本HBV DNA的性能存在显著差异，在常规临床实践中互换用于临床决策时务必慎重。但由于本研究评估临床性能时所用血清样本量较小，是否影响临床决策有待进一步研究。
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